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（三）萋－尼氏染色
1、涂片自然干燥后，放置在染色架上，玻片间距保持在10 mm以上的距离；火焰固定(在5秒钟内将玻片置于火焰上来回烘烤4次)。
2、滴加石碳酸复红染液，盖满痰膜，火焰加热至出现蒸汽后，脱离火焰，保持染色5分钟。染色期间应始终保持痰膜被染色液覆盖，必要时可续加染色液。加温时勿使染色液沸腾。
3、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去染色液，沥去标本上剩余的水。
4、自痰膜上端外缘滴加脱色剂布满痰膜，脱色1分钟；如有必要，需流水洗去脱色液后，再次脱色至痰膜无可视红色为止。
5、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去脱色液，沥去玻片上剩余的水。
6、滴加亚甲蓝复染液，染色30秒钟。
7、流水自玻片一端轻缓冲洗，冲去复染液，沥去标本上剩余的水。待玻片干燥后镜检。
一张染色合格的痰玻片，由于被亚甲蓝染色而呈亮蓝色。将染色后的玻片放置在报纸上，如果报纸上的文字透过痰膜不能被看清，表明该玻片涂抹过厚。
（四）显微镜检查
1、使用10倍目镜双目显微镜读片。
2、取染色完毕且已干燥的玻片，痰膜向上放置在玻片台上并以卡尺固定。首先使用40倍物镜，转动卡尺移动玻片至痰膜左端，将光线调节至适当亮度，调节焦距至可见细胞形态；移开40倍物镜，在玻片上滴1～2滴镜油，使用100倍油镜进行细致观察。在淡蓝色的背景下，抗酸菌呈红色，其他细菌和细胞呈蓝色。为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁镜头直接接触玻片上的痰膜。
3、读片方法：首先应从左向右观察相邻的视野；当玻片移动至痰膜一端时，纵向向下转换一个视野，然后从右向左观察，依此类推。通常10×20 mm大小的痰膜，使用100倍油镜，每行可观察100个视野，观察三行则约为300个视野。仔细观察完300个视野，一般至少需要5分钟以上。一位镜检人员连续阅读10-12张玻片后应休息约20分钟。
4、分枝杆菌的基本形态：当患者标本直接进行涂片镜检时，能够发现不同种的分枝杆菌形态。结核分枝杆菌多数为杆状、稍弯曲；菌体宽度0.3～0.6µm；菌体长度不一，在0.5～8µm之间，多数在1.5～3.5µm；含结核分枝杆菌较多的新鲜标本经萋－尼氏染色后，100倍油镜观察，可见单个存在的，也能看到聚集成簇或分枝状排列的菌体，染色良好痰标本，可见菌体内着色较深的异染颗粒。
（五）镜检结果报告与登记
痰涂片镜检的结果报告，不仅是对结核病的诊断提供依据，报告的数量也一定程度的反映疾病严重程度和传染性的大小。痰涂片镜检结果的登记应按照镜检结果的分级报告标准登记在结核病细菌学实验室登记本上和痰检验单上。不能只填写阴性、阳性或
(－)、( + )等。
萋尼氏染色镜检结果分级报告标准
抗酸杆菌阴性
(－)：连续观察300个不同视野未发现抗酸杆菌。
报告抗酸杆菌菌数：
1～8条/300视野。
抗酸杆菌阳性（
1＋）：3～9条/100视野。
抗酸杆菌阳性（
2＋）：1～9条抗酸杆菌/10视野。
抗酸杆菌阳性（
3＋）：1～9条抗酸杆菌/每视野。
抗酸杆菌阳性（
4＋）：≥10条抗酸杆菌/每视野。
（六）抗酸染色玻片的处理
阅读完萋尼氏染色玻片后，应立即用浸满二甲苯（分析醇）的擦镜纸揭取数次，彻底去除玻片上的镜油。经脱油干燥后的玻片，按实验室序号及涂片编号放置在玻片盒中，存放在阴凉干燥的环境中，以备复检或质控抽检。
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