B1　玻片凝集试验
　　B1.1　目的
　　应用玻片凝集试验对Nm病原菌株或带菌者菌株进行血清学分群。
　　B1.2　材料
　　B1.2.1　待检的Nm菌株纯培养物。
　　B1.2.2　Nm诊断血清：多价I(包含A、B、C、D群)，多价Ⅱ〔包含1889(Y)、1890(H)、1892(29E)］，多价Ⅲ［包含319(W135)、1916(X)、1486(I)、1811(K)群］及各群单价血清，共计14种。
　　B1.2.3　洁净载玻片。
　　B1.2.4　生理盐水。
　　B1.3　试验方法
　　B1.3.1　先将诊断血清按说明书稀释成所需的浓度，滴一滴在洁净的玻片上。
　　B1.3.2　用白金耳刮取菌苔少许，在玻片上沾取少量血清，在一旁研磨均匀，再与血清混匀。
　　B1.3.3　轻轻摇动玻片数次，在1～2min内出现明显凝集者，即为阳性。
　　B1.3.4　检查从病人分离的疑似Nm时，先试A群血清，若不与其发生凝集，则试用B或C群血清，仍不凝集时，则试用多价Ⅱ或多价Ⅲ血清。若发生凝集，再用单价血清定群。从病人分离的疑似Nm对现有诊断血清皆不凝集者则送研究单位进一步鉴定。
　　B1.3.5　在玻片上与各群诊断血清、盐水或正常兔血清皆发生凝集者，即定为自凝菌。
　　B2　酶联免疫吸附试验(ELISA)
　　B2.1　目的应用ELISA间接法测病人急性期和恢复期血清中的抗体水平。此方法也可以应用于健康者血清抗体的测定。
　　B2.2　材料
　　B2.2.1　酶联免疫吸附试验检测仪。
　　B2.2.2　聚苯乙烯板(40孔或96孔)。
　　B2.2.3　加样器(单头或4头或8头，定量为0～200μL)。
　　B2.2.4　羊抗人IgG辣根过氧化酶结合物。
　　B2.2.5　试验质控血清(抗体阳性和阴性的人血清)。
　　B2.2.6　菌体抗原(A、B和C群Nm标准菌株)或A群Nm多糖菌苗。
　　B2.2.7　包被液(0.05mol/L碳酸盐缓冲液)：
　　碳酸氢钠(NaHCO3)　　　　　　　　2.9g
　　碳酸钠(Na2CO3)　　　　　　　　　1.6g
　　叠氮钠(NaN3)　　　　　　　　　　0.2g
　　加蒸馏水至1000mL，pH9.6，置4℃可备用两周。
　　B2.2.8　洗涤液(0.5mol/L氯化钠)：
　　氯化钠(NaCl)　　　　　　　　　　29.3g
　　吐温－20(Tween－20)　　　　　　 0.5mL
　　加蒸馏水至1000mL，临用前配制。
　　B2.2.9　稀释液：
　　氯化钠(NaCl)　　　　　　　　　　　　　　　　　8.0g
　　磷酸二氢钾(KH2PO4)　　　　　　　　　　　　　　0.2g
　　磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)　　　　　　　　　　2.9g
　　氯化钾(KCl)　　　　　　　　　　　　　　　　　 0.2g
　　吐温－20(Tween－20)　　　　　　　　　　　　　 0.5mL
　　加蒸馏水至1000mL，pH7.4，置4℃备用。
　　B2.2.10　底物缓冲液：
　　(1)0.2mo1/L磷酸氢二钠
　　磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)　35.8g
　　蒸馏水　　　500mL
　　(2)0.1mol/L柠檬酸
　　柠檬酸〔C3H4(OH)(COOH)3·H2O］　10.5g
　　蒸馏水　　　　500mL
　　(1)液和(2)液分别置4℃备用。
　　临用前按下述配方配制底物溶液，pH为5.0：
　　(1)液　　　　2.57mL
　　(2)液　　　　2.43mL
　　邻苯二胺　　　　4mg
　　蒸馏水　　　　　5mL
　　30％H2O2　　　15μL
　　B2.2.11　填充液：
　　稀释液　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 100mL
　　白明胶或牛血清白蛋白(Bovine　Serium　Albumin，BSA)　0.5g
　　B2.2.12　终止溶液：2mo1/L硫酸(H2SO4)。
　　B2.3　试验步骤
　　B2.3.1　包被抗原的制备
　　将Nm纯培养的菌苔刮到生理盐水中，离心(3000r/min，30min)洗涤菌体3次，再混悬于生理盐水中，置56℃30min灭活，用比浊法测定菌悬液中细菌浓度，用包被液将其稀释成106个菌/mL作为包被抗原。对于A群Nm，亦