乙类：流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则 GB 16884-1997_

乙类：流行性脑脊髓膜炎诊断标准及处理原则 GB 16884-1997

作者：佚名　|　来源：不详　|　发布日期：07-11-01 15:39:17　| 点击次数：[]　|　文字调整[大][中][小]

Triphenyl　Tetrazolium　Chloride，TTC)琼脂培养基(TTC琼脂)
　　B3.2.5.1　TTC琼脂配方：
　　牛肉膏0.5％，氯化钠0.5％，日本多胨3.0％，可溶性淀粉0.2％，以蒸馏水配制，调pH7.4～7.6，琼脂0.5％。
　　B3.2.5.2　TTC琼脂制作
　　上述培养基成分熔化后，按每10mL或20mL分装于大试管，121℃灭菌15min，冷却后置4℃备用。临用前将培养基加热熔化，每10mL培养基加50％葡萄糖注射液0.1mL，1％TTC水溶液(4℃避光保存)0.1mL，混匀放在45℃水溶液中待用。
　　B3.2.5.3　阳性参考血清
　　用Nm免疫兔制备的诊断血清，未加防腐剂，经预试测定其杀菌抗体滴度较高(1∶3200以上)。
　　B3.2.5.4　滴管与滴头
　　采用临床上输液用的玻璃输液接头作滴管，滴头采用12号输液针，在砂轮上磨去针头的斜面部分，使其下口呈圆形。用滴管与滴头滴稀释液应是40滴/mL±2滴/mL。它们可用于滴加稀释液、补体、靶菌液、TTC琼脂及待检血清。如有条件，血清最好用25μL移液器稀释。
　　B3.3　杀菌抗体测定步骤
　　B3.3.1　靶菌液的制备
　　B3.3.1.1　开启A、B或C群Nm菌种，接种到巧克力色琼脂平皿上，37℃二氧化碳孵箱或烛缸培养15～20h，挑取3～5个菌落涂于另一平皿，同上培养10～15h。
　　B3.3.1.2　用Nm诊断血清和生理盐水进行玻片凝集及显微镜检查，以核实菌种。
　　B3.3.1.3　菌种被确证以后，取其菌苔，混匀于2mL灭菌脱脂牛奶管中，制成浓菌液，分装若干支小试管，每管约0.2mL，置-20℃以下保存，Nm可存活3～6个月。
　　B3.3.1.4　需用靶菌时，取出一支上述牛奶菌种管，熔化后立即转种并放在4℃冰箱内保存，供每日分离靶菌制作菌悬液，可备用2周。在测定抗体的过程中，每次所用靶菌传种的代数保持一致。
　　B3.3.1.5　从所分离的靶菌平皿上挑取3～5个典型菌落，涂抹转种1/4巧克力色琼脂平皿，37℃烛缸培养4～6h，刮取菌苔，于盛有3.5mL左右稀释液的试管壁上用白金耳将其充分研磨，制成轻度混浊的均匀菌悬液，其光密度值相当于0.1。
　　B3.3.1.6　取出上述菌悬液2mL加到0.5cm的比色杯内，在波长为540nm的分光光度计上测其光密度值。
　　B3.3.1.7　稀释液用量按式(B1)计算：
　　X＝OD×10-0.1……………………………(B1)
　　式中：X--稀释液用量，mL；
　　OD--光密度值。
　　按照式(B1)计算稀释液用量，然后往里加入0.1mL靶菌悬液，此时相当于光密度值为0.1的靶菌液作了10倍稀释。吹吸均匀后，由其开始再连续作10倍稀释至10－5稀释度，以菌液的最终浓度为每毫升含4000个菌落形成单位为宜。稀释时每个稀释度更换一个移液枪头。
　　B3.3.1.8　稀释好的靶菌悬液在1h内用完。若室温较高，可将菌液管置冰浴中，以防靶菌迅速死亡。
　　B3.3.2　杀菌抗体的测定
　　B3.3.2.1　先在微滴板每孔内加1滴相当于25μL的稀释液。
　　B3.3.2.2　用移液器从每排第一孔内加25μL经56℃30min灭活的待检血清，吹吸5～10次后吸出25μL至下一孔，如此作连续倍比稀释至最后一孔。每份血清分别用一支移液枪头。
　　B3.3.2.3　从低温冰箱内取出补体，于37℃温水中摇动将其速溶，每孔加一滴。若补体已冷冻干燥，可往安瓿内加相当于补体血清原体积的稀释液，使其融化后即刻使用。
　　B3.3.2.4　每孔加一滴稀释成合适浓度的靶菌菌液，微滴板置微型振荡器上中速振荡5min，再在37℃培养25min，取出后重复上述振荡。
　　B3.3.2.5　每孔加2滴已熔化冷至45℃左右的TTC琼脂后，微滴板置37℃烛缸内培养15～20h后观察结果。
　　B3.3.2.6　每次试验需做下列对照：
　　阳性参考血清对照；4孔补体对照(稀释液、补体、菌液各一滴，检查补体自然杀菌活性)；4孔细菌生长对照(稀释液、灭活补体和靶菌菌液

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